Incrivel Remedio/lançamento para diversas doenças (MIX)
1. Introdução:
1.2. Sepse:
A sepse é considerada uma inflamação intravascular não controlada, não regulada e auto-sustentável, resultando no desequilíbrio entre a liberação de mediadores antiinflamatórios que promovem lesão em nível endotelial, em órgãos, além de ocorrer disfunção microvascular, déficit na oxigenação tecidual, entre outros. (BEUTLER et al., 2001). Os processos inflamatórios caracterizam-se pela liberação de mediadores pró-infamatórios, que juntamente com os componentes bacterianos ativam monócitos, neutrófilos, e células endoteliais a liberarem outros produtos pró-inflamatórios, amplificando assim, a resposta inflamatória (BAUER, 2002). Os macrófagos e os neutrófilos são dois tipos de células envolvidas na resposta imune inata e estão intimamente associados com a resposta inflamatória que ocorre na sepse severa. Estas células podem produzir e responder à liberação de citocinas, quimiocinas, e outros mediadores inflamatórios liberados do endotélio e do epitélio. A liberação de citocinas quimiotáticas (quemiocinas) no local inflamado promove a quimiotaxia de neutrófilos, e dentre as substâncias quimiotáticas destacam-se: o peptídeo N-formil (NFP), as frações derivadas do sistema complemento (C5a, C5b-9,o leucotrieno B4 (LTB4), a interleucina 8 (IL-8), o fator ativador de plaquetas (PAF), a proteína 1α inflamatória de macrófago (MIP 1α) e a proteína 1β inflamatória de macrófago (MIP 1β), que desencadeiam o recrutamento e a ativação de células mononucleares e de neutrófilos no local da inflamação (LA et al., 2001). Os neutrófilos contribuem para a lesão tecidual por meio da liberação de radicais livres (O2-, OH-), utilizando-se do sistema de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase (NADPH), liberando enzimas proteolíticas (elastase, catepsina G e proteinases), estimulando a liberação de citocinas através da ativação de células em nível local e promovendo maior recrutamento leucocitário (VERMEIREN et al., 2000)
Estudos epidemiológicos demonstram que ocorrem 751.000 novos casos de sepse a cada ano, em adultos, nos Estados Unidos da América, representando 2,26 casos em 100 admissões hospitalares, e tendo uma mortalidade de 215.000 casos por ano (ANGUS et al., 2001). O “American College of Chest Physicans/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference”, em 1992, descreveu e identificou as manifestações clínicas encontradas na sepse como sendo uma infecção de resposta sistêmica, onde as características encontradas são: taquicardia, taquipnéia, alterações na temperatura, leucocitose, e disfunção sistêmica de diversos órgãos (coração, pulmão, fígado e rim) (AMERICAN COLLEGE, 1992).
1.2. Modelo animal de sepse:
Várias hipóteses tem sido postuladas em relação à fisiopatologia da sepse. Antes da utilização de um modelo específico de sepse, devem-se avaliar suas vantagens e desvantagens, além de sua correlação com a condição séptica humana. Pode-se citar como exemplo, que em muitos pacientes, o processo patológico envolve uma lesão persistente, que resulta em lesão pulmonar ou disfunção progressiva de diferentes órgãos. Comumente a morte do paciente com sepse ocorre após o desenvolvimento de falência múltipla de órgãos que ocorre dias ou semanas após o estímulo inicial. Por esta razão, os modelos animais que levam a uma significante mortalidade de 6-12 h após a lesão não podem ser descritos como relevantes para se correlacionar com a sepse humana, pois nestes modelos o animal não possui tempo suficiente para desenvolver todas as manifestações de uma resposta clínica séptica. A escolha de que espécie animal utilizar é outra importante variável que deve ser considerada, principalmente quando da interpretação dos resultados. Espécies animais de pequeno porte, como ratos, camundongos ou cobaias, são freqüentemente utilizados para análise de sobrevida, já que uma grande quantidade de animais é requisitada. Os camundongos também são as espécies preferenciais empregadas tanto para a avaliação de características das linhagens genéticas, quanto na utilização de linhagens knock-out e trangênicas. Já a utilização animais de grande porte (porcos) possui vantagens, tendo em vista possuir a fisiologia renal, cardiovascular e gastrointestinal muito similares aos humanos (DEITCH, 1998).
Os modelos experimentais propostos para o estudo da sepse podem ser classificados em modelos de infecção como: o modelo de infusão intravenosa, o da peritonite e o modelo da endotoxicose, que permitem avaliar o estudo da fisiopatologia deste processo inflamatório (DEITCH, 1998). No entanto, alguns procedimentos experimentais não mimetizam qualitativamente e quantitativamente as características patológicas observadas na sepse em humanos (BAUER, 2002), sendo assim, a escolha adequada do modelo experimental a ser utilizado é de suma importância para a obtenção de resultados que possam ser correlacionados com a sepse humana. Um destes modelos compatíveis foi o idealizado por Witherman em 1980, onde o ceco é obstruído mecanicamente com um fio inabsorvível distal à válvula íleo-cecal, sendo perfurado com instrumento perfuro-contuso, conhecido como ligadura e perfuração cecal (LPC). Este modelo possui as vantagens por promover uma resposta cardiovascular hiperdinâmica, com aumento da falência cardíaca e diminuição da resistência vascular sistêmica, similar àquela observada em humanos. Concomitantemente, o animal desenvolve bacteremia e os sinais da sepse sistêmica, tornam-se progressivos ao longo do tempo, culminando em morte. Além disso, este modelo é extremamente relevante para análise de terapias de suporte e utilização de fluidos de ressuscitação, e pode ser utilizado com sucesso tanto em espécies animais de grande como de pequeno porte (DEITCH, 1998). Além disso, são muitas as similaridades deste modelo realizado com contaminação peritoneal polimicrobial, aos acidentes de carros, apendicites supuradas e diverticulites em humanos. No entanto, é necessário enfatizar que a avaliação dos modelos clínicos de sepse ou choque séptico bem como as utilizações de drogas são importantes para o entedimento fisiopatplógico, bem como o desenvolvimento de nova terapia para o tratamento da doença (DEITCH, 1998).
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
2.1.1. Avaliar o efeito dos compostos FACE e MIX no modelo experimental de sepse induzida pelo extravasamento fecal em camundongos após o tratamento prévio de três dias consecutivos, administrando-se as concentrações de 80 e 160 mL dos produtos.
2.2.Objetivos específicos
2.2.2. Pesquisar o efeito do FACE e do MIX sobre a cinética dos leucócitos no sangue de animais com sepse, comparando-se os resultados obtidos com animais não-tratados.
2.2.3. Investigar o efeito do FACE e do MIX sobre a cinética dos leucócitos no lavado da cavidade peritoneal de animais com sepse, comparando-se os resultados obtidos com animais não-tratados.
2.2.4. Avaliar o efeito do FACE e do MIX sobre a resposta inflamatória local em camundongos, medindo-se o exsudato, na cavidade peritoneal.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. ANIMAIS
O trabalho experimental utilizou camundongos albinos-Suiços, com 2 meses de idade de ambos os sexos, pesando entre 25-30 g. Os animais serão mantidos em ambiente com ciclo claro-escuro controlado de 12 h, em gaiolas de plástico, com livre acesso à água e à comida.
3.2. MODELO DE INFLAMAÇÃO UTILIZADO
3.2.1. Peritonite induzida pelo extravasamento fecal, em camundongos
Neste protocolo experimental, cada animal será inicialmente anestesiado com hidrato de cloral, estes serão fixados pelas quatro patas com fita adesiva, em mesa operatória. Uma incisão longitudinal de 1-2 cm será realizada, na região mediana do abdômen, utilizando-se tesoura. A seguir, será realizada a abertura da musculatura e do peritônio, seguida da identificação do ceco na cavidade abdominal. Este será tracionado para fora da cavidade e posteriormente procedida à ligadura do colo com fio de seda, logo acima da entrada do íleo terminal. Após esta etapa, com auxílio de agulha (18 G), o segmento do intestino grosso será perfurado três vezes, logo abaixo da entrada do íleo terminal, em região avascular. O ceco será manipulado para que uma pequena quantidade de fezes extravase, e devolvido novamente à cavidade abdominal, sendo a musculatura e a pele imediatamente suturadas com fio de polipropileno 5,0, em sutura contínua. Além disso, os animais recém-operados serão mantidos em gaiolas de plástico isoladas e sob aquecimento de luz (300C) durante 1-2 horas.
De acordo com o procedimento experimental, para a análise da exsudação nas cavidades abdominal, alguns animais serão tratados com solução de azul de Evans (25 mg/kg, 0,2 mL/animal, i.v.), 1 h antes do procedimento cirúrgico (FRÖDE et al, 2001). A seguir, os animais serão sacrificados, em diferentes períodos de tempo (4-72 h), por deslocamento cervical e as cavidades abdominais serão abertas e lavadas com 1 mL de solução tampão fosfato-heparinizado (20 UI/mL) (PBS: composição: pH 7,6: NaCl 137 mM; KCl 2 mM e tampão fosfato 10 mM).
3.3.1. Contagem total dos leucócitos na cavidade abdominal e no sangue de animais com sepse
No dia dos experimentos, após sacrifício dos animais e abertura das cavidades abdominais, alíquotas do lavado abdominal (200 mL) serão reservadas para a contagem total celular. Em alguns experimentos, os animais serão anestesiados previamente com hidratro de cloral e as amostras de sangue total serão coletadas através da punção cardíaca, em tubo contendo anticoagulante (ácido etilenodiaminotetracético: EDTA). Paralelamente, grupo de animais não-tratados serão utilizados para comparação dos resultados obtidos com animais sépticos tratados com as drogas de interesse.
3.6. ANÁLISE ESTATÍSTÍCA
Para os resultados da média de sobrevida dos animais serão utilizado a curva de Kaplan-Meier. Os parâmetros inflamatórios estudados serão expressos através da média ± erro padrão da média (e.p.m). Diferenças estatísticas entre os parâmetros analisados com seus respectivos grupos-controle foram determinados utilizando-se ANOVA (paramétrico) e complementado com Dunnett’s (paramétrico) ou quando necessário o teste “t” de Student (não-pareado).
4. RESULTADOS
Nesta série de experimentos foi determinado o perfil temporal dos leucócitos no lavado da cavidade abdominal, no sangue e análise do edema local após um tratamento prévio de três dias consecutivos utilizando-se os compostos MIX e FACE quando estes eram administrados em dois grupos distintos nas concentrações de 80 e 160 mL dos produtos. Após este período de tempo realizou-se a indução da peritonite e 24 h após os animais foram sacrificados.
Pode-se observar que, apesar de não significativo, houve uma redução dos leucócitos na cavidade peritoneal dos camundongos tratados com 160mL de MIX , e FACE nos volumes de 80 e 160 mL dos produtos.
Além disso, observou-se que os níveis de leucócitos no sangue também apresentaram uma diminuição quando comparados com o grupo de animais não tratados 24 h.
A análise do edema foi realizada apenas com os volumes de 80 mL dos produtos MIX e FACE, e resultados demonstraram que o tratamento prévio com MIX na concentração de 80 mL reduz significativamente o edema local após a indução da peritonite 24 h.
5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO:
Sabendo que a sepse é uma patologia com elevada mortalidade, efetuar a pesquisa dos parâmetros inflamatórios em modelos animais apresenta uma série de dificuldades pela evolução do óbito que os mesmos apresentam durante a investigação. Mas podemos observar que houve uma redução na mortalidade dos animais que eram submetidos ao tratamento com o MIX (resultados não mostrados).
Os animais induzidos à peritonite quando tratados previamente com MIX na concentração de 80 mL apresentaram uma redução significativa no edema local quando comparados com os respectivos controles (animais não tratados).
Apesar de não significativa ocorreu uma diminuição dos leucócitos tanto na cavidade peritoneal como no sangue dos animais submetidos ao tratamento prévio com os produtos.
Levando-se em consideração que a mortalidade elevada é que faz da sepse uma patologia de enorme importância clínica, podemos concluir que resultados obtidos poderiam servir de suporte para terapias durante a evolução do quadro clínico já que a falência dos órgãos ocorre de forma rápida, em decorrência a liberação dos mecanismos pró-inflamatórios estimulados por infecção bacteriana. Além disso, na sepse são detectados importantes alterações na perfusão de vários tecidos, culminando com a falência de múltiplos órgãos (MCMILLEN et al., 1993) e as alterações importantes de edema observada localmente poderíam apresentar conseqüências sistêmicas.
Sendo assim:
É fundamental a replicação do experimento para confirmação dos resultados encontrados.
Além disso, faz-se necessária a investigação de novas doses e diferentes tempos de tratamento pós e pré-operatórios.
A confirmação dos resultados coloca o produto MIX na classe das drogas anti-edematogênicas.
Início 